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导语

2022年8月6日，陕西第四军医大学唐都医院在《Bioactive Materials》上揭晓题为“Dynamic degradation patterns of porous polycaprolactone/β-tricalcium phosphate composites orchestrate macrophage responses and immunoregulatory bone regeneration”的文章，建设了一个稳固的体外降解模子来研究生物可降解聚己内酯/β-磷酸三钙(PT)支架在降解历程中的物理化学和生物学性子的转变。

利来国际生物有幸为实验部分提供了mRNA测序手艺和效劳。

下面就由小编和各人分享该文章

揭晓期刊：Bioactive Materials

影响因子：16.874

揭晓时间：2022.08

作者单位：陕西第四军医大学唐都医院

研究要领：mRNA-seq

文章链接：Dynamic degradation patterns of porous polycaprolactone/β-tricalcium phosphate composites orchestrate macrophage responses and immunoregulatory bone regeneration

文章提要

生物降解聚己内酯/β-磷酸三钙（PT）复合质料是骨组织工程应用的理想候选质料。本研究验证了具有差别因素的PCL/β-TCP支架在降解的每个阶段对骨愈合的影响都有很大差别。PT46和PT37支架比TCP含量较低的PT支架降解得更快，体内实验批注PT（PT46和PT37）支架的快速降解扰乱了巨噬细胞反应，导致骨愈合失败。PT37支架降解产品的吞噬作用诱导巨噬细胞中的氧化应激和炎症M1极化。本研究展现了可降解骨支架生物降解的动态模式高度协调免疫反应，从而决议了骨再生的乐成。因此，通过评估生物质料在整个降解历程中对免疫反应和骨再生的生物效应，有须要开发更具远景的骨再生生物质料。

手艺蹊径

研究效果

1.3D打印PCL/β-TCP复合支架的理化和成骨性能表征

研究团队制作了一系列生物活性PCL/TCP（PT）支架，通过SEM、micro-CT评估了外貌形态，并举行了压缩测试、热性能测试以及验证了对成骨细胞的成骨作用，发明具有更高TCP含量的支架导致增强的ALP活性，尤其是PT37支架。

2.支架生物降解动态降解模子的构建

接着，研究团队设计并开发了一种先进的动态生物降解反应器来模拟体内生物降解情形，研究了几种先前报道的降解介质对动态降解反应器中PT支架降解的影响。视察到稀氢氧化钠溶液诱导稳固的降解模式类似于体内植入的支架的降解模式，体外降解支架的micro-CT横截面也证实了动态降解反应器的功效。

3.PCL/β-TCP支架因素对体内骨再生的影响

体内实验发明，相较于PT73、PT64和PT55支架，PT46和PT37支架诱导异常的骨再生模式: 在4周时快速骨新生，在10周和16周时延迟骨形成。

4.PT支架降解模式对免疫反应和巨噬细胞极化的影响

通过SEM、残留支架的微型CT重修和支解，均证实了PT73、PT64和PT55支架的稳固降解以及PT46和PT37支架的快速降解两种模式 。时代，Masson染色切片的高倍率成像显示了大宗的多核巨细胞 (mngc) 散布在PT46和PT37支架的支架区。为了探讨快速降解对巨噬细胞反应后期的影响，作者通过组织免疫荧光染色研究修复历程中差别阶段PT支架内巨噬细胞的极化，发明PT73、PT64和PT55支架的M1to-M2巨噬细胞转换可能有利于骨修复，而在PT46和PT37组中视察到的恒定M1极化可能导致骨修复失败。

5.PT支架体外和体内降解阶段的匹配

于是作者首先通过SEM-EDS研究了植入体内后4、10和16周支架降解的外貌形态和响应的元素漫衍，将4、10和16周后体内PT支架的元素组成和降解的转变划分与体外的早期 (D1) 、中期 (D2) 和晚期 (D3) 对应起来。

6.体外PT支架降解差别阶段的巨噬细胞极化切换

在体外，研究团队将RAW264.7巨噬细胞与差别降解阶段的支架共作育，研究支架降解对巨噬细胞极化和细胞因子渗透的生物学影响。通过免疫荧光染色视察M1和M2巨噬细胞marker基因表达并检测M1和M2 marker卵白表达，比照发明与PT73和PT55支架差别，P37支架巨噬细胞从D1到D3阶段M1 marker基因表达升高，M2 marker基因降低，促炎IL-6和TNF-α 表达升高。使用ALP活性检测批注在D2和D3阶段用PT37支架作育的巨噬细胞二1212显著抑制成骨细胞ALP活性，而在D2和D3阶段用PT73和PT55支架二1212显著增强ALP活性。

7.PT支架降解阶段对体内巨噬细胞极化的影响

体内实验使用免疫荧光染色研究了PT支架内巨噬细胞的漫衍和极化。视察到与体外作育实验中一致的巨噬细胞转换的模式。 

8.RNA-seq验证降解D2阶段PT支架对巨噬细胞极化的影响

为了更好地相识降解的支架对巨噬细胞极化的生物学作用，研究团队举行了RNA测序 (RNA-seq)，以剖析在降解的D2阶段用PT55和PT37支架体外作育的巨噬细胞中的基因表达。差别基因GO富集和网络剖析批注，在PT37 D2组中，免疫反应，防御反应，对外部刺激功效的反应和急性炎症反应均显着提高。这些功效注释显示，与D2阶段的PT55支架相比，D2阶段的PT37支架在巨噬细胞中诱导了强烈的免疫反应和急性炎症反应。KEGG剖析显示，加入免疫系统、熏染性疾病和信号12分子和相互作用途径的基因富集; TNF信号通路、NFkappa B信号通路和同种异体移植倾轧通路显著上调 (图8D和F)。值得注重的是，吞噬体通路也是PT37 D2组中上调的通路之一，这批注吞噬功效和吞噬体通路可能有助于用PT支架作育的巨噬细胞的极化。

9.降解产品吞噬和吞噬体形成对巨噬细胞氧化应激和极化的影响

由于KEGG通路的富集提醒吞噬功效和吞噬体通途可能在巨噬细胞对降解支架的反应中施展主要作用，研究团队针对吞噬功效举行了探讨，发明PT37组溶酶体的数目和荧光强度更高，并且视察到在PT37 D2支架上作育的巨噬细胞中的一些溶酶体的群集，在D2阶段用PT37支架作育的巨噬细胞中的吞噬体显着大于用其他PT支架作育的巨噬细胞中的吞噬体。同时，PT37支架在D2阶段显著增进了ROS爆发酶NOX2的表达，并抑制了ROS消除酶SOD1的表达 。流式细胞术剖析证实，在D2阶段用PT37支架作育诱导巨噬细胞爆发的ROS高于其他结痂。

为了进一步确定在D2阶段PT37支架的DPs是否诱导了巨噬细胞中视察到的反应应激和M1极化，作者用氯丙嗪 (CPM，内吞抑制剂) 或latrunculin B (LcB，吞噬抑制剂) 预处置惩罚巨噬细胞2小时，发明LcB对吞噬作用的抑制显着减轻了在D2阶段用PT37支架作育的巨噬细胞的M1极化。并且用CPM和LcB举行预处置惩罚后，在D2阶段用PT37支架作育的巨噬细胞中降低NOX-2的表达。

总结：

本研究展现了可降解骨支架生物降解的动态模式高度协调免疫反应，从而决议了骨再生的乐成。因此，通过评估生物质料在整个降解历程中对免疫反应和骨再生的生物效应，有须要开发更具远景的骨再生生物质料。